微生物檢測常見的方法有:生長量測定法、微生物計數(shù)法、生理指標法和商業(yè)化快速微生物檢測等,本文列舉了一些常用檢測方法的的原理、應用范圍和優(yōu)缺點。
微生物生長意味著原生質(zhì)含量的增加,所以測定的方法也都直接或間接的以次為根據(jù),而測定繁殖則都要建立在計數(shù)這一基礎上。微生物生長的衡量,可以從其重量,體積,密度,濃度,做指標來進行衡量。
一、生長量測定法
1、體積測量法:又稱測菌絲濃度法。
原理:通過測定一定體積培養(yǎng)液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況。菌絲濃度測定法是大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長的一個重要監(jiān)測指標。這種方法比較粗放,簡便,快速,但需要設定一致的處理條件,否則偏差很大,由于離心沉淀物中夾雜有一些固體營養(yǎng)物,結果會有一定偏差。
2、稱干重法:
原理:利用離心或過濾法測定。一般干重為濕重的10-20%。稱干重發(fā)法較為煩瑣,通常獲取的微生物產(chǎn)品為菌體時,常采用這種方法,如活性干酵母(activity dry yeast, ADY),一些以微生物菌體為活性物質(zhì)的飼料和肥料。
3、比濁法:
原理:微生物的生長引起培養(yǎng)物混濁度的增高。通過紫外分光光度計測定一定波長下的吸光值,判斷微生物的生長狀況。該法主要用于發(fā)酵工業(yè)菌體生長監(jiān)測。
4、菌絲長度測量法:
方法:對于絲狀真菌和一些放線菌,可以在培養(yǎng)基上測定一定時間內(nèi)菌絲生長的長度。
二、微生物計數(shù)法
1、血球計數(shù)板法:
這種方法簡便,直觀,快捷,但只適宜于單細胞狀態(tài)的微生物或絲狀微生物所產(chǎn)生的孢子進行計數(shù),并且所得結果是包括死細胞在內(nèi)的總菌數(shù)。
2、染色計數(shù)法:
為了彌補一些微生物在油鏡下不易觀察計數(shù),而直接用血球計數(shù)板法又無法區(qū)分死細胞和活細胞的不足,人們發(fā)明了染色計數(shù)法。
3、比例計數(shù)法:
將已知顆粒(如霉菌孢子或紅細胞)濃度的液體與一待測細胞濃度的菌液按一定比例均勻混合,在顯微鏡視野中數(shù)出各自的數(shù)目,即可得未知菌液的細胞濃度。
4、液體稀釋法:
對未知菌樣做連續(xù)十倍系列稀釋,根據(jù)估計數(shù),從最適宜的三個連續(xù)的10倍稀釋液中各取5毫升試樣,接種1毫升到3組共15只裝培養(yǎng)液的試管中,經(jīng)培養(yǎng)后記錄每個稀釋度出現(xiàn)生長的試管數(shù),然后查最大或然數(shù)表MPN(most probably number)得出菌樣的含菌數(shù),根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)計算出活菌含量。該法常用于食品中微生物的檢測,例如飲用水和牛奶的微生物檢查。
5、平板菌落計數(shù)法:
這是一種常用的活菌計數(shù)法。但方法比較麻煩,操作者需有熟練的技術。平板菌落計數(shù)法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數(shù),而且同時將菌液中的細菌進行了一次分離培養(yǎng),獲得了單克隆。
6、試劑紙法:
在平板計數(shù)法的基礎上,發(fā)展了小型商品化產(chǎn)品以供快速計數(shù)用。試劑紙法計數(shù)快捷準確,相比而言避免了平板計數(shù)法的人為操作誤差。
7、膜過濾法:
用特殊的濾膜過濾一定體積的含菌樣品,經(jīng)丫叮橙染色,在紫外顯微鏡下觀察細胞的熒光,活細胞會發(fā)橙色熒光,而死細胞則發(fā)綠色熒光。
三、生理指標法
微生物的生長伴隨著一系列生理指標發(fā)生變化,例如酸堿度,發(fā)酵液中的含氮量,含糖量,產(chǎn)氣量等,與生長量相平行的生理指標很多,它們可作為生長測定的相對值。
1、測定含氮量:
大多數(shù)細菌的含氮量為干重的12.5%,酵母為7.5%,霉菌為6.0%。根據(jù)含氮量×6.25,即可測定粗蛋白的含量。含氮量的測定方法有很多,如用硫酸,過氯酸,碘酸,磷酸等消化法和Dumas測氮氣法。
2、測定含碳量:
將少量(干重0.2-2.0 mg)生物材料混入1毫升水或無機緩沖液中,用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在100 0C下加熱30分鐘后冷卻。加水稀釋至5毫升,在580nm的波長下讀取吸光光度值,即可推算出生長量。需用試劑做空白對照,用標準樣品做標準曲線。
3、還原糖測定法:
還原糖通常是指單糖或寡糖,可以被微生物直接利用,通過還原糖的測定可間接反映微生物的生長狀況,常用于大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長的常規(guī)監(jiān)測。
4、氨基氮的測定:
方法是,離心發(fā)酵液,取上清液,加入甲基紅和鹽酸作指示劑,加入0.02N的NaOH調(diào)色至顏色剛剛褪去,加入底物18%的中性甲醛,反應數(shù)刻,加入0.02N的使之變色,根據(jù)NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根據(jù)培養(yǎng)液中氨基氮的含量,可間接反映微生物的生長狀況。
5、其他生理物質(zhì)的測定:
P,DNA,RNA,ATP,NAM(乙酰胞壁酸)等含量以及產(chǎn)酸,產(chǎn)氣,產(chǎn)CO2(用標記葡萄糖做基質(zhì)),耗氧,黏度,產(chǎn)熱等指標, 都可用于生長量的測定。也可以根據(jù)反應前后的基質(zhì)濃度變化,最終產(chǎn)氣量,微生物活性三方面的測定反映微生物的生長。
四、商業(yè)化快速微生物檢測法
微生物的檢測,其發(fā)展方向是快速,準確,簡便,自動化,當前很多生物制品公司利用傳統(tǒng)微生物檢測原理,結合不同的檢測方法,設計了形式各異的微生物檢測儀器設備,正逐步廣泛應用于醫(yī)學微生物檢測和科學研究領域。這些儀器和設備的生產(chǎn)廠家很多,產(chǎn)品各異,在此不做一一介紹,具體可查看各公司的產(chǎn)品說明。